hi prend ni dy bagaimana cara membuat Kompleks Besi (III) – Tris (1,10 Phenantrolin). reagen ini biasanya digunakan untuk mendeteksi adanya asam urat...
ni dy caranya :
·Besi (III)
Larutan besi (III) 1000 ppm dibuat dengan cara melarutkan 1,208 gram FeCl3.6H2O ditambah 0,625 mL H2SO4 0,005 M lalu ditambah dengan aquadest sampai dengan 250 mL.
·Tris (1,10 Phenantrolin)
Larutan tris (1,10-phenantrolin) 1000 ppm dibuat dengan cara melarutkan 0,273 gram phenantrolin dalam aquadest sampai 250 mL sambil dipanaskan.
·Kompleks Besi (III) – Tris (1,10 Phenantrolin)
Campurkan larutan besi (III) dan tris (1,10-phenantrolin) dengan perbandingan volume (1:3) diperoleh konsentrasi 1000 ppm (Prihatiningrum, 2007).
Kingdom : Plantae Divisi : Spermatophyta Sub Divisi : Angiospermae Kelas : Monocotyledonae Ordo : Zingiberales Famili : Zingiberaceae Genus : Curcuma Species : Curcuma xanthorrhiza ROXB
Nama Daerah (MMI) Sumatra : Temu lawak (Melayu): Jawa : Koneng gede (Sunda) : Temulawak (Jawa) : Temo labak ( Madura ) Indonesia : TemulawakSpecies lain dari kerabat dekat temu lawak adalah tanaman temu ireng (C. aeruginosa ROXB), temu putih (C. zeodaria ROSC.), dan temu kunyit (C. domestica VAL.). Temulawak mempunyai beberapa nama daerah, di antaranya adalah koneng gede (Sunda), temo lobak (Madura), dan Temu lawak (Indonesia).
Ekologi dan Penyebaran Tumbuh di seluruh pulau Jawa, tumbuh liar di bawah naungan di hutan jati, di tanah yang kering dan di padang alang – alang , ditanam atau tumbuh liar di tegalan; tumbuh pada ketinggian tempat 5 m sampai 1500 m di atas permukaan laut.
Morfologi Tanaman Batang
Batang temu lawak termasuk tanaman tahunan yang tumbuh merumpun. Tanaman ini berbatang semu dan habitusnya dapat mencapai ketinggian 2 – 2,5 meter. Tiap rumpun tanaman terdiri atas beberapa tanaman (anakan), dan tiap tanaman memiliki 2 – 9 helai daun.
Daun Daun tanaman temulawak bentuknya panjang dan agak lebar. Lamina daun dan seluruh ibu tulang daun bergaris hitam. Panjang daun sekitar 50 – 55 cm, lebarnya + 18 cm, dan tiap helai daun melekat pada tangkai daun yang posisinya saling menutupi secara teratur. Daun berbentuk lanset memanjang berwana hijau tua dengan garis – garis coklat. Habitus tanaman dapat mencapai lebar 30 – 90 cm, dengan jumlah anakan perumpun antara 3 – 9 anak.
Bunga Bunga tanaman temu lawak dapat berbunga terus-menerus sepanjang tahun secara bergantian yang keluar dari rimpangnya (tipe erantha), atau dari samping batang semunya setelah tanaman cukup dewasa. Warna bunga umumnya kuning dengan kelopak bunga kuning tua, serta pangkal bunganya berwarna ungu. Panjang tangkai bunga + 3 cm dan rangkaian bunga (inflorescentia) mencapai 1,5 cm. Dalam satu ketiak terdapat 3-4 bunga.
Rimpang Rimpang induk temu lawak bentuknya bulat seperti telur, dan berukuran besar, sedangkan rimpang cabang terdapat pada bagian samping yang bentuknya memanjang. Tiap tanaman memiliki rimpang cabang antara 3 – 4 buah. Warna rimpang cabang umumnya lebih muda dari pada rimpang induk. Warna kulit rimpang sewaktu masih muda maupun tua adalah kuning-kotor. Atau coklat kemerahan. Warna daging rimpang adalah kuning atau oranye tua, dengan cita rasanya amat pahit, atau coklat kemerahan berbau tajam, serta keharumannya sedang. Rimpang terbentuk dalam tanah pada kedalaman + 16 cm. Tiap rumpun tanaman temu lawak umumnya memiliki enam buah rimpang tua dan lima buah rimpang muda. Akar Sistem perakaran tanaman temu lawak termasuk akar serabut. Akar-akarnya melekat dan keluar dari rimpang induk. Panjang akar sekitar 25 cm dan letaknya tidak beraturan.
Kandungan Tanaman Rimpang temulawak mengandung kurkuminoid , mineral minyak atsiri serta minyak lemak. Tepung merupakan kandungan utama, jumlahnya bervariasi antara 48 – 54 % tergantung dari ketinggian tempat tumbuhnya, makin tinggi tempat tumbuhnya makin rendah kadar tepungnya. Selain tepung , temulawak juga mengandung zat gizi antara lain karbohidrat, protein dan lemak serta serat kasar mineral seperti kalium ( K ), natrium ( Na), magnesium (Mg ), zat besi (Fe), mangan (Mn ) dan Kadmium ( Cd). Komponen utama kandungan zat yang terdapat dalam rimpang temulawak adalah zat kuning yang disebut ” kurkumin” dan juga protein ,pati, serta zat – zat minyak atsiri.Minyak atsiri temulawak mengandung phelandren, kamfer, borneol, xanthorrizol, tumerol dan sineal. Kandungan kurkumin berkisar antara 1,6% – 2,22% dihitung berdasarkan berat kering. Berkat kandungan dan zat – zat minyak atsiri tadi, diduga penyebab berkhasiatnya temulawak.
Kandungan Zat Aktif Temulawak Kurkumin, kurkuminoid, P-toluilmetilkarbinol, seskuiterpen d-kamper, mineral, minyak atsiri serta minyak lemak, karbohidrat, protein, mineral seperti Kalium (K), Natrium (Na), Magnesium (Mg), Besi (Fe), Mangan (Mn), dan Kadmium (Cd).
Mekanisme Kerja Kurkuminoid
Kurkumin yang dapat menurunkan SGOT dan SGPT sampai tingkat normal.
Kurkuminoid dalam temulawak dapat meningkatkan sekresi cairan empedu yang berguna untuk mengemulsikan lemak serta dapat menurunkan kadar lemak dalam darah dan hepatoprotektor.
P-toluilmetilkarbinol dan seskuiterpen d-kamper untuk meningkatkan produksi dan sekresi empedu serta turmeron sebagai antimikroba.
Minyak atsiri berefek merangsang produksi empedu dan sekresi pankreas serta mempunyai kemampuan sebagai bakterisid maupun kemampuan melarutkan kolesterol. Pada dosis tinggi, minyak atsiri dapat menurunkan kadar enzim glutamate Oksaloasetat transaminase dalam serum (SGOT) dan enzim glutamate Piruvat transaminase dalam serum (SGPT)
Dosis Temulawak Sebagai Bahan Aktif Suatu Obat
Sumiati Yuningsih, Jurusan Farmasi FMIPA UNPAD, 1991. Infus rimpang temulawak 10% b/v dengan dosis 6,8 dan 10 ml/hari dapat menurunkan kadar SGOT dan SGPT darah kelinci yang terinfeksi virus hepatitis B.
Abdul Naser, Jurusan Farmasi FMIPA, UNPAD, 1987. Ekstrak temulawak dapat menurunkan kadar kolesterol total dan trigliserida darah dalam keadaan hiperlipidemia, tetapi tidak berpengaruh pada HDL kolesterol.
Robert Edward Aritonang, Jurusan Farmasi FMIPA, UNPAD, 1988. Pemberian kurkuminoid temulawak dapat menurunkan kadar kolesterol total dan bilirubin total. Product.
Edhie Santosa Rahmat, SW Setianingrum, Fakultas Kedokteran UNDIP, 2006. Asupan oral ekstrak kasar temulawak dengan dosis 50 mg per hari selama 35 hari dapat meningkatkan nafsu makan pada penderita anoreksia primer kelompok dewasa muda.
Boesro Soebagio, Sri Soeryati, Fauziah K, Jurusan Farmasi FMIPA UNPAD, 2006. Ekstrak rimpang temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb) dengan konsentrasi antara 1,9 – 7,6% b/v dalam sediaan krim dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis.
Cerita ini ditulis oleh seorang wartawan di Taiwan sehubungan dengan adanya gosip mengenai makanan penambah kekuatan dan stamina yang dibuat dari sari/kaldu janin manusia.
Healthy Soup yang dipercaya dapat mendapat stamina dan keperkasaan pria terbuat dari janin bayi manusia berumur 6 – 8 bulan. Salah seorang pengusaha pemilik pabrik di daerah Tong Wan , Taiwan mengaku sebagai pengkonsumsi tetap
�Healthy Soup�..
Sebagai hasilnya, pria berusia 62 tahun menjelaskan khasiat Healthy Soup ini mempertahankan kemampuannya untuk dapat berhubungan seks beberapa kali dalam semalam. Penulis diajak oleh pengusaha tersebut di atas ke salah satu restoran yang menyediakan Healthy Soup di kota Fu San – Canton dan diperkenalkan kepada juru masak restoran tersebut. Kata sandi untuk Healthy Soup adalah BAIKUT.
Juru masak restoran menyatakan jenis makanan tersebut tidak mudah didapat karena mereka tidak tersedia ready stock. Ditambahkan pula bahwa makanan tersebut harus disajikan secara fresh, bukan frozen.
Tetapi kalau berminat, mereka menyediakan ari-ari bayi (plasenta) yang dipercaya dapat meningkatkan gairah seksual dan juga obat awet muda. Juru masak restoran tersebut mengatakan jika memang menginginkan Healthy Soup, dia menganjurkan untuk datang ke sebuah desa di luar kota dimana ada sepasang suami istri yang istrinya sedang mengandung 8 bulan. Diceritakan pula bahwa si istri sebelumnya sudah pernah mengandung 2 kali, tetapi kedua anaknya lahir dengan jenis kelamin perempuan. Jika kali ini lahir perempuan lagi, maka Healthy Soup dapat didapat dengan waktu dekat.
Cara pembuatan �Healthy Soup�, seperti yang diceritakan oleh jurnalis yang meliput kisah ini adalah sebagai berikut:
Janin yang berumur beberapa bulan, ditambah Pachan, Tongseng, Tongkui, Keichi, Jahe, daging ayam dan Baikut, di tim selama 8 jam, setelah itu dimasak selayaknya memasak sup.
Beberapa hari kemudian seorang sumber menghubungi penulis untuk memberitahukan bahwa di Thaisan ada restoran yang sudah mempunyai stok untuk Healthy Soup. Bersama sang pengusaha, penulis dan fotografer pergi ke restoran di Thaisan untuk bertemu dengan juru masak restoran tersebut yang tanpa membuang waktu langsung mengajak rombongan untuk tour ke dapur. Di atas papan potong tampak janin tak bernyawa itu tidak lebih besar dari seekor kucing.
Sang juru masak menjelaskan bahwa janin tersebut baru berusia 5 bulan, tidak dijelaskan berapa harga belinya, yang pasti itu tergantung besar-kecil, hidup-mati janin tersebut dan sebagainya (Masya Allah!!!)
Kali ini, harga per porsi Healthy Soup 3,500 RMB karena stok sedang sulit untuk didapat. Sambil mempersiapkan pesanan kami, dengan terbuka juru masak tersebut menerangkan bahwa janin yang keguguran atau digugurkan, biasanya mati, dapat dibeli hanya dengan beberapa ratus RMB saja, sedang kalau dekat tanggal kelahiran dan masih hidup, bisa semahal 2.000 RMB. Urusan bayi itu diserahkan ke restoran dalam keadaan hidup atau mati, tidak ada yg mengetahui. Setelah selesai, Healthy Soup disajikan panas di atas meja, penulis dan fotografer tidak bernyali untuk ikut mencicipi, setelah kunjungan di dapur, sudah kehilangan semua selera makan, maka cepat-cepat meninggalkan mereka dengan alasan tidak enak badan.
Menurut beberapa sumber, janin yang dikonsumsi semua adalah janin bayi perempuan. Apakah ini merupakan akibat kebijaksanaan pemerintah China untuk mewajibkan satu anak dalam satu keluarga yg berlaku sampai sekarang, atau hanya karena kegemaran orang akan makanan sehat sudah mencapai kondisi yang sangat terkutuk.
Catatan: Sebagai manusia beragama dan berpikiran sehat, kita untuk apapun. Bangsa manusia adalah bangsa yang derajatnya paling tinggi dari mahluk di bumi ini, dan tindakan tersebut adalah tindakan yang sesungguhnya bukan berasal dari pemikiran manusia waras. memilukan hati.
Sebagai manusia beragama dan berpikiran sehat, kita untuk apapun. Bangsa manusia adalah bangsa yang derajatnya paling tinggi dari mahluk di bumi ini, dan tindakan tersebut adalah tindakan yang sesungguhnya bukan berasal dari pemikiran manusia waras. memilukan hati.
Temen – temen yang aku sayangi dan yang aku cintai (huweek,, huweeekk,,) tao nggak klo gaya berciuman dipengaruhi oleh zodiak Kalian. Nyang belom tao ne tak kaseh tao nyak..!!! Tapi jangan dipraktekin sebelom nikah. Dosa..!!!!
Aries Orang-orang Aries ternyata memiliki gaya berciuman yang cepat dan penuh dengan nafsu. Tapi sayangnya ciuman dahsyat tersebut biasanya cepat pula selesainya.
Taurus Berbeda dengan mereka yang berada di bawah naungan Aries, ciuman orang Taurus umumnya berlangsung sangat perlahan, tidak tergesa-gesa, tenang, penuh kemesraan dan berlangsung terus…terus…dan terus.
Gemini Orang-orang Gemini konon merupakan pribadi yang hangat dan ceria. Tidak heran jika gaya berciuman mereka terkadang diselingi oleh senyuman bahkan juga tawa lebar. Asyiknya, sifat warga Gemini yang terkenal gemar melakukan sesuatu yang baru itu pun dilakukannya dalam melakukan ciuman. Jadi banyak kejutannya!
Cancer Warga Cancer memang terkenal dengan sikapnya yang hati-hati, agak tertutup dan cenderung ingin selalu dilindungi. Tak heran jika dalam urusan berciuman mereka lebih suka melakukannya dengan lembut, hangat, dan seperti tidak mau lepas saja!
Leo Orang-orang Leo yang terkenal keras dan tegas ternyata memiliki gaya berciuman yang liar, tanpa malu-malu, bahkan tidak segan-segan untuk menggigit dan mencakar! Warga bintang berlambang singa ini ternyata sangat senang jika mendapat pujian dari pasangannya, apalagi pujian atas gairahnya yang luar biasa.
Virgo Warga Virgo memiliki gaya berciuman yang halus, lembut, rapi, sampai-sampai sang pasangan pun bakal terkesima dibuatnya.
Libra Gaya berciuman warga Libra konon kurang hangat! Kenapa? Karena mereka pada umumnya terlalu khawatir dengan urusan macam-macam di luar hasrat mereka. Belum lagi, mereka gemar menghela nafas di tengah-tengah ciuman.
Scorpio Konon, orang-orang di bawah naungan Scorpio rupanya tidak terlalu suka dengan ciuman. Karenanya, jangan kaget apabila dalam sebuah hubungan intim mereka kerap melewatkan aktivitas yang satu itu dan lebih suka langsung menuju sasaran.
Sagitarius Berbahagialah Anda yang berbintang Sagitarius atau pun yang memiliki pasangan dengan bintang ini. Pasalnya, mereka yang berbintang dengan lambang busur panah ini memiliki gaya berciuman yang mengejutkan, spontan, dan menggairahkan. Tak heran jika banyak orang yang menanti-nanti ciuman ala si Sagitarius ini.
Capricorn Ciuman-ciuman yang didaratkan oleh orang-orang berbintang Capricorn kabarnya amat sangat romantis. Bahkan saking romantisnya, ciuman ala mereka kerap menjadi obat pembunuh stress!
Aquarius Sesuai dengan lambangnya, air, warga Aquarius ternyata memiliki ciuman yang basah dan agak serabutan. Selain itu, pada saat ciuman berlangsung mereka umumnya cenderung membuka mata lebar-lebar.
Pisces Orang-orang dengan bintang berlambang ikan ini memiliki gaya berciuman pandangan mata tajam, penuh nafsu dan gairah, serta, wow, berlangsung cukup lama!
Pada pengobatan uveitis sering dipergunakan kortikosteroid dengan dosis imunosupresi dan dalam jangka waktu lama, yangdapat menimbulkan efek samping yang tidak diingini. Obat-obatsitostatika yang dipakai sebagai imunosupresan juga dapat menimbulkan efek samping yang lebih serius. Selain itu keduajenis obat tersebut tidak spesifik dalam menekan peradangan intraokular, sehingga sering terjadi kegagalan pengobatan yang akan berakhir dengan kebutaan. Maka perlu dicari altematif pengobatan yang lain yang lebih efektif dan aman. Siklosporin A (CsA) adalah salah satu obat imunosupresan yang relatif ban’ yang tidak menimbulkan efek samping terlalu berat dan bekerja lebih selektif terhadap sel limfosit T tanpa menekan seluruh imunitas tubuh; pada pemakaian kortikosteroid dan sitostatik akan terjadi penekanan dari sebagian besar sistem imunitas, seperti menghambat fungsi sel makrofag, sel monosit dan sel neutrofil. Selain itu CsA tidak menyebabkan depresi sumsum tulang dan tidak mengakibatkan efek mutagenik seperti obat sitostatika. Uveitis terjadi akibat hipersensitivitas tipe III (response imun-complex) seperti pada uveitis fakoanafilaktik dan vaskulitis pada penyakit Behcet, dan tipe IV (lambat) seperti pada Oftalmia simpatika, penyakit Behcet, sarkoidosis dan lain-lain. Tetapi Nussenblatt mengatakan bahwa peranan reaksi tipe III pada uveitis terbatas, sedangkan reaksi tipe IV sangat penting dalam menerangkan mekanisme penyakit peradangan intraokular.
Mekanisme kerja siklosporin A dalam respons imun adalah spesifik dengan :
Menekan secara langsung sel T helper subsets dan menekan secara umum produksi limfokin-limfokin (IL-2, interferon, MAF, MIF). Secara umum CsA tidal( menghambat fungsi sel B.
Produksi sel B sitotoksik dihambat oleh CsA dengan blocking sintensis IL-2.
Secara tidak langsung mengganggu aktivitas sel NK (natural killer cell) dengan menekan produksi interferon, di mana interferon dalam mempercepat proses pematangan dan sitolitik sel NK.
Populasi makrofag dan monosit tidak dipengaruhi oleh CsA sehingga tidak mempengaruhi efek fagositosis, processing antigen dan elaborasi IL-1.
Mekanisme kerja kortikosteroid dalam response imun :
Secara invitro menekan blastogenesis sel T.
Menekan produksi sel T sitotoksik secara langsung dan blocking sintesis limfokin/lymphotoxic factor.
Menekan respons makrofag dan sel monosit, sehingga menekan aktivitas fagositosis, microbicidal, digestion intracellulare partikel antigen dan elaborasi plasminogen activation factor.
Respons imun humoral (imunoglobulin) relatif resisten terhadap efek CsA.
Mekanisme kerja sitostatika dalam respons imun :
Menekan secara langsung produksi antibodi.
Menghambat fungsi sel T sitotoksik.
Menghambat fungsi sel T suppresor sehingga produksi antibodi berkurang.
Populasi makrofag dan sel monosit relatif resisten terhadap sitostatika walaupun obat ini menekan produksi MAF dan MIF.
Hasil penelitian prospektif CsA pada pasien uveitis yang re rakter terhadap pengobatan konvensional di RSCM memberikan hasil yang cukup baik dalam hal memperbaiki penglihatan dan menekan peradangan dengan efek samping minimal.
DNA yang akan dipotong adalah DNA plasmid hasil isolasi yang mengandung 0,1-5 μg DNA, sedangkan enzim restriksi yang digunakan adalah enzim EcoRI. Enzim ini diperoleh dari bakteri E. coli dan memotong DNA dari ujung 5’ sampai 3’. langkah pertama yang dilakukan pada percobaan ini adalah memasukkan buffer, EcoRI, dan air ke dalam tabung ependorf. Buffer berfungsi untuk mempertahankan pH optimum bekerjanya enzim EcoRI. EcoRl memotong DNA rantai ganda dimana urutan basa-basa nya adalah guanin,adenin ,adenin, timin, timin, dan sitosin. Enzim restriksi EcoRI memotong DNA yang panjang menjadi fragmen-fragmen DNA yang lebih pendek.
GAATTC
CTTAAG
Selanjutnya larutan divorteks agar larutan tersebut homogen. DNA kemudian dimasukkan ke dalam ependorf dan diinkubasi pada suhu 37ºC selam 1,5 jam. Suhu 37ºC merupakan suhu optimum bekerjanya enzim restriksi EcoRI dalam memotong DNA selama masa inkubasi.
Langkah selanjutnya adalah menyiapkan agarose gel elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan cara elektroforesis. Gel yang dibuat mengandung 0,8% agarose. Agarose dibuat dari agarose dan larutan TBE kemudian dipanaskan untuk melarutkan agarose pada larutan TBE. Setelah larut, larutan agarose dituang dalam cetakan tempat running DNA dan didiamkan hingga membeku. Larutan DNA yang sudah diinkubasi kemudian ditambahkan larutan ethidium bromide yang berfungsi untuk mengikat DNA dan agar DNA berpendar ketika dipaparkan pada sinar UV-VIS. Larutan ethidium bromide bersifat karsinogen sehingga harus hati-hati dalam penggunannya. Gel yang sudah membeku dibuat sumuran sebagai tempat meletakkan DNA, dan DNA yang sudah diberi larutan ethidium bromide selanjutnya dimasukkan ke dalam sumuran dan dilakukan running. Running yang dilakukan dengan cara elektroforesis, yaitu dengan mengalirkan listrik muatan positif dan negative pada gel. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Fragmen (potongan) DNA yang berukuran lebih kecil akan bergerak dari kutub negative ke kutub positif akan lebih cepat dibandingkan DNA yang berukuran lebih besar. Untuk menegtahui besar suatu fragmen DNA, digunakan marker DNA yang telah diketahui ukurannya.
Pada percobaan ini, DNA yang telah direkstriksi tidak terbaca pada foto tetapi yang terlihat adalah plasmid yang masih utuh atau plasmid yang masih sirkuler dan memiliki berat molekul yang besar. Dari foto, terlihat fragmen DNA besar yang menunjukkan bahwa DNA tersebut belum terpotong. Seharusnya, pada foto tampak fragmen-fragmen (band-band) kecil yang menunjukkan potongan-potongan DNA yang telah dipotong oleh enzim restriksi. Hal ini dikarenakan terjadi kontaminasi dari bakteri E. coli liar dari udara sehingga yang terfoto adalah DNA E. coli liar yang tidak dipotong dengan enzim EcoRI.
Teknologi DNA rekombinan, yang sering disebut sebagai rekayasa genetika, telah membawa revolusi biologi dan semakin berdampak terhadap banyak bidang. DNA merupakan biopolimer kompleks yang disusun dalam bentuk Heliks-ganda. Unsur dasart penyusun adalah rangkaian basa purin (adenin (A) atau guanin (G) dan pirimidin (Sitosin (C) atau timin (T)). Semua basa ini terikat pada posisi C-1’ dalam gula deoksiribosa dan semua basa tersebut disatukan lewat penggabungan gula pada posisi 3’ dan 5’ melalui ikatan fosfodiester. Gugus deoksiribosa dan fosfat yang silih berganti, membentuk tulang punggung heliks-gandq tersebut. Ikatan 3’-5’ ini juga menentukan arah suatu benang tertentu molekul DNA, dan karena ada dua utas benang yang berjalan berlawanan arah, maka benang-benang DNA tersebut dikatakan antiparalel.
Gen ditranskripsikan ke dalam RNA. Informasi umumnya mengalir dari DNA kepada mRNA kepada protein, peristiwa ini merupakan proses yang dikendalikan secara ketat dan melibatkan sejumlah tahapan yang kompleks, yang masing-masing jelas diatur oleh satu atau lebih enzim atau factor lain.
Pemisahan dan manipulasi DNA, termasuk penyambungan rangkaian ujung-ke-ujung dari sumber-sumber yang sangat berbeda untuk membentuk molekul-molekulchimetric (misalnya molekul yang mengandung baik rangkaian DNA manusia maupun bakteri dengan cara yang tidak tergantung pada rangkaian), merupakan inti dalam riset DNA rekombinan.
Enzim-enzim endonuklease tertentu, yaitu enzim yang memotong DNA pada rangkaian DNA yang spesifik di dalam molekul (sehingga berbeda dengan enzim-enzim eksonuklease, yang mencernakan dari ujung-ujung molekul DNA), merupakan alat kunci dalam riset DNA rekombinan. Enzim-enzim ini pada mulanya dinamakan enzim restriksi, karena keberadaannya dalam dalam suatu bakteri tertentu akan membatasi pertumbuhan virus bakteri tertentu yang disebut bakteriofaga. Enzim restriksi memotong DNA menjadi sejumlah potongan pendek dengan cara spesifik-rangkaian yang berbeda dengan kebanyakan metode enzimatik, kimiawi ataupun fisika lainnya yang memutuskan DNA secara acak. Enzim-enzim defensif ini melindungi DNA bakteri yang menjadi hospes tehadap DNA dari organisme asing (terutama organisme faga yang infektif). Enzim-enzim DNA metilase yang spesifik, tempat dan enzim restriksi selalu terdapat dalam bentuk pasangan didalam bakteri.
Enzim-enzim restriksi diberi nama menurut bakteri dimana enzim tersebut diisolasikan. Sebagai contoh, Eco RI berasal dari Escherichia coli, dan Bam HI Bacillus amyloliquefaciens. Tiga huruf dalam enzim restriksi terdiri atas huruf pertama yang menyatakan genus (E) dan dua huruf berikutnya yang menyatakan spesies (co). Tiga huruf ini dapat diikuti dengan symbol strain (R) dan angka romawi (I) untuk menunjukkan urutan penemuan. Setiap enzim akan menbgenali dan memotong rangkaian DNA benang-benang yang spesifik, yaitu rangkaian dengan panjang 47 bp. Potongan DNA akan menghasilkan ujung tumpul atau ujung bertumpuk, menurut mekanisme yang digunakan oleh enzim tersebut.
Tahapan-tahapan dalam rekayasa genetika adalah sebagai berikut:
1.Membuat Kompeten Sel
Dalam rekayasa genetika atau bioteknologi proses transformasi gen pada bakteri, khususnya pada Escherichia coli, membuat kompeten sel merupakan salah satu langkah yang penting. Tujuan proses kompeten sel adalah untuk mengkondisikan sel bakteri sehingga dapat menyerap DNA yang berbentuk sirkuler dalam proses kompeten sel.
Pada proses kompeten sel membran sel bakteri akan membentuk suatu pori-pori yang dapat dimasuki oleh DNA sirkuler. Bakteri yang diperlakukan dengan kalsium klorida (CaCl2) mampu menyerap DNA bacteriophage l. Kemampuan bakteri yang telah kompeten untuk menyerap DNA adalah sangat singkat yaitu sekitar 1-2 hari, kecuali diperlakukan dengan penyimpanan yang benar.
2.Transformasi Sel Kompeten
Transformasi merupakan proses untuk memasukkan DNA plasmid hasil konstruksi yang telah mengandung gen target ke dalam sel target. Proses transformasi ke sel bakteri pada umumnya menggunakan metode heat shock, tetapi dapat juga menggunakan metode listrik secara elektroporasi. Penggunaan metode heat shock juga lebih murah dibandingkan dengan metode elektroporasi.
Dalamproses transformasi gen ke sel bakteri, macam vektor plasmid yang digunakan harus diketahui karakternya dengan jelas, terutama sistem ekspresi dan macam gen ketahanan terhadap antibiotik yang digunakan. Pada umumnya, sistem ekspresi yang digunakan adalah sistem operon yang dapat diinduksi oleh senyawa tertentu. Kebanyakan operon yang digunakan adalah lactose operon yang dapat diinduksi oleh senyawa IPTG ( iso-propyl–thio-galaktosidase). Lac-operon digunakan untuk mengekspresikan gen yang mengkode enzim beta galaktosidase. Enzimini akan mengkonversi senyawa 5-bromo-4-cloro-3indolil-beta-D-galaktosidase (X-gal) yang tidak berwarna menjadi derivat indigo yang berwarna biru. Apabila gen Lac Z disisipi oleh sekuen DNA tertentu, maka gen Lac Z-nya terputus sehingga enzim beta galaktosidase tidak terbentuk. Akibat tidak terbentuknya enzim beta galaktosidase, maka substrat X-gal tidak dikoversikan menjadi derivat indigo sehingga koloni tetap berwarna putih. Dengan demikian, koloni yang berwarna putih adalah koloni yang berhasil ditransformasi, .sedangkan koloni barwarna biru merupakan bakteri yang tidak tertransformasi. Seleksi dengan metode ini disebut dengan blue white colony selection. Blue white colony selection merupakan salah satu cara dalam menseleksi bakteri yang telah berhasil ditransformasi.
3.Seleksi Bakteri Transforman
Untuk mengetahui bakteri mana yang telah berhasil ditransformasi plasmid hasil konstruksi yang memiliki gen untuk mengekspresikan sifat resistensi terhadap antibiotiktertentu, bakteri tersebut kemudian dikulturkan dalam medium yang mengandung antibiotik tersebut. Bakteri yang tidak berhasil ditransformasikan dengan plasmid hasil konstruksitersebut akan mati karena tidak memiliki plasmid sehingga tidak resisten terhadap antibiotik. Bakteria yang dapat tumbuh akan dipisahkan antara satu dengan lain dan dibiarkan tumbuh membentuk koloni. Perlu diingatkan bahwa proses ini melibat beribu-ribu plasmid dan DNA sasaran yang tidak dapat dilihat dengan mata kasar. Plasmid umumnya dalam bentuk larutan cair.
Tidak semua plasmid dapat dikonstruksi dengan enzim restriksi. Walau dapat dikonstruksi, tidak semua plasmid dapat disisipkan dengan DNA target. Ada plasmid yang dapat dikonstruksi dan dapat menyatu kembali tanpa bergabung dengan DNA target. Walaupun ada plasmid yang dapat dilakukan penyisipan, tidak semua berhasil ditransfomasi ke dalam sel bakteri traget. Dengan ini perlu dilakukan seleksi untuk memilih hanya sel perumah yang hanya mengandung DNA rekombinan (rDNA). Saringan yang pertama dilakukan dengan menggunakan penanda saringan terhadap antibiotik. Andaikan plasmid yang dipilih mempuyai resitensi terhadap antibiotik ampicilin (ampR) dan lac Z sebagai tapak pemotongan enzim EcoRI yang digunakan untuk mensintesiskan b-galaktosidase jika melakukan lac operon. Sekiranya sel perumah gagal ditransformasikan vektor plasmid, maka sel perumah tersebut tidak mempunyai plasmid untuk daya tahan terhadap antibiotik dan sel perumah tersebut musnah. Dengan itu kita dapat memilih sel perumah yang mana ada vektor plasmid atau tidak. Masalah selanjutnya adalah adakah sel perumah tersebut mengandung plasmid yang telah telah dipotong oleh enzim pembatasan atau tidak. Pemecahannya adalah dengan dilakukan dengan mengkultur bakteria tersebut dalam medium X-gal (mengandung laktosa). X-gal akan berubah warna menjadi biru sekiranya menyatu dengan b-galaktosidase. Lac Z dipotong oleh enzim restriksi untuk tujuan penyisipan DNA sumber, dengan itu bakteria lac Z menjadi rusak dan tidak berupaya mensintesis bgalaktosidase dan akan menghasilkan koloni berwarna putih di dalam medium X-gal. Masalah ketiga adakahplasmid yang telah dikonstruksi oleh enzim restriksi tersebut akan disisipkan oleh DNA sumber atau plasmid tersebut timbul kembali tanpa bergabung dengan DNA sumber. Proses seterusnya ialah identifikasi gen melalui ‘genetic probe’. Genetic probe adalah segmen RNA atau segmen rantai tunggal DNA yang menjadi pelengkap kepada gen yang diperlukan dan telah ditandai dengan bahan radioaktif.
Koloni sel perumah yang mengandung plasmid dipindahkan kepada membran nilon. Membran nilon akan diberi dengan ‘genetic probe’ yang akan berpasangan dengan bes-bes pada rDNA yang telah terbuka. Kemudian akan dibilas sekiranya bes yang tidak berikatan akan disingkirkan dan bes yang berikatan akan tetap berada dalam membran. ‘Genetic probe’ kemudian difoto dengan film x-ray. Dengan itu kita dapat memilih sel perumah yang mengandung DNA rekombinan.
4.Pemotongan DNA dengan Enzim Endonuklease dan Elektroforesis
Enzim restriksi (endonuklease) adalah enzim yang berasal dari bakteri yang berasal dari bakteri yang mampu memotong DNA double strain. Istilah enzim restriksi berasal dari kenyataan bahwa enzim ini merupakan produk dari satu straind bakteri yang membatasi pertumbuhan berikutnya dari bakteri lain tertentu pada medium yang sama Dalam sel bakteri, enzim ini berfungsi sebagai perlindungan diri dengan cara memotong DNA asing pada sisi pemotongan tertentu. Endonuklease dapat mengenal urutan (sekuen) nukleutida pendek, antara 4-8 nukleutida, yang sering dikenal sebagai restriction site atau sisi pemotongan atau situs pemotongan yang spesifik dan berbeda-beda.. Telah diketahui kira-kira 200 enzim restriksi dan masing-masing enzim restriksi memotong DNA rantai ganda pada urutan spesifik dari 4 atau 6 basa. EcoRl merupakan salah satu enzim restriksi yang memotong DNA rantai ganda dimana urutan basa-basanya adalah guanin, adenin ,adenin, timin, timin, dan sitosin .
GAATTC
CTTAAG
Karena EcoRl memotong setiap DNA hanya pada urutan yang benar, maka DNA yang berasal dari sumber–sumber yang jelas berbeda dapat dipotong dan disambung bersama berdasarkan adanya ekor-ekor rantai tunggal yang komplementer yang disebut ujung staggered. Pemotongan yang sempurna dari DNA total dengan enzim ini akan memotong DNA tadi apabila terdapat urutan GAATTC dan apabila setiap plasmid mempunyai DNA identik, maka DNA total akan selalu dipotong oleh EcoRl menjadi fragmen-fragman yang sangat banyak yang tepat sama.
5.Elektroforesis dengan Agarose Gel
elektroforesis dengan agarose gel digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Fragmen (potongan) DNA berukuran lebih kecil akan bergerak dari kutub (-) ke kutub (+) akan lebih cepat dibandingkan dengan DNA yang berukuran besar. Untuk mengetahui besar suatu fragmen DNA ditentukan marker DNA yang telah diketahui ukurannya.
