DNA yang akan dipotong adalah DNA plasmid hasil isolasi yang mengandung 0,1-5 μg DNA, sedangkan enzim restriksi yang digunakan adalah enzim EcoRI. Enzim ini diperoleh dari bakteri E. coli dan memotong DNA dari ujung 5’ sampai 3’. langkah pertama yang dilakukan pada percobaan ini adalah memasukkan buffer, EcoRI, dan air ke dalam tabung ependorf. Buffer berfungsi untuk mempertahankan pH optimum bekerjanya enzim EcoRI. EcoRl memotong DNA rantai ganda dimana urutan basa-basa nya adalah guanin,adenin ,adenin, timin, timin, dan sitosin. Enzim restriksi EcoRI memotong DNA yang panjang menjadi fragmen-fragmen DNA yang lebih pendek.
G A A T T C
C T T A A G
Selanjutnya larutan divorteks agar larutan tersebut homogen. DNA kemudian dimasukkan ke dalam ependorf dan diinkubasi pada suhu 37ºC selam 1,5 jam. Suhu 37ºC merupakan suhu optimum bekerjanya enzim restriksi EcoRI dalam memotong DNA selama masa inkubasi.
Langkah selanjutnya adalah menyiapkan agarose gel elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan cara elektroforesis. Gel yang dibuat mengandung 0,8% agarose. Agarose dibuat dari agarose dan larutan TBE kemudian dipanaskan untuk melarutkan agarose pada larutan TBE. Setelah larut, larutan agarose dituang dalam cetakan tempat running DNA dan didiamkan hingga membeku. Larutan DNA yang sudah diinkubasi kemudian ditambahkan larutan ethidium bromide yang berfungsi untuk mengikat DNA dan agar DNA berpendar ketika dipaparkan pada sinar UV-VIS. Larutan ethidium bromide bersifat karsinogen sehingga harus hati-hati dalam penggunannya. Gel yang sudah membeku dibuat sumuran sebagai tempat meletakkan DNA, dan DNA yang sudah diberi larutan ethidium bromide selanjutnya dimasukkan ke dalam sumuran dan dilakukan running. Running yang dilakukan dengan cara elektroforesis, yaitu dengan mengalirkan listrik muatan positif dan negative pada gel. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Fragmen (potongan) DNA yang berukuran lebih kecil akan bergerak dari kutub negative ke kutub positif akan lebih cepat dibandingkan DNA yang berukuran lebih besar. Untuk menegtahui besar suatu fragmen DNA, digunakan marker DNA yang telah diketahui ukurannya.
Pada percobaan ini, DNA yang telah direkstriksi tidak terbaca pada foto tetapi yang terlihat adalah plasmid yang masih utuh atau plasmid yang masih sirkuler dan memiliki berat molekul yang besar. Dari foto, terlihat fragmen DNA besar yang menunjukkan bahwa DNA tersebut belum terpotong. Seharusnya, pada foto tampak fragmen-fragmen (band-band) kecil yang menunjukkan potongan-potongan DNA yang telah dipotong oleh enzim restriksi. Hal ini dikarenakan terjadi kontaminasi dari bakteri E. coli liar dari udara sehingga yang terfoto adalah DNA E. coli liar yang tidak dipotong dengan enzim EcoRI.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar