Teknologi DNA rekombinan, yang sering disebut sebagai rekayasa genetika, telah membawa revolusi biologi dan semakin berdampak terhadap banyak bidang. DNA merupakan biopolimer kompleks yang disusun dalam bentuk Heliks-ganda. Unsur dasart penyusun adalah rangkaian basa purin (adenin (A) atau guanin (G) dan pirimidin (Sitosin (C) atau timin (T)). Semua basa ini terikat pada posisi C-1’ dalam gula deoksiribosa dan semua basa tersebut disatukan lewat penggabungan gula pada posisi 3’ dan 5’ melalui ikatan fosfodiester. Gugus deoksiribosa dan fosfat yang silih berganti, membentuk tulang punggung heliks-gandq tersebut. Ikatan 3’-5’ ini juga menentukan arah suatu benang tertentu molekul DNA, dan karena ada dua utas benang yang berjalan berlawanan arah, maka benang-benang DNA tersebut dikatakan antiparalel.
Gen ditranskripsikan ke dalam RNA. Informasi umumnya mengalir dari DNA kepada mRNA kepada protein, peristiwa ini merupakan proses yang dikendalikan secara ketat dan melibatkan sejumlah tahapan yang kompleks, yang masing-masing jelas diatur oleh satu atau lebih enzim atau factor lain.
Pemisahan dan manipulasi DNA, termasuk penyambungan rangkaian ujung-ke-ujung dari sumber-sumber yang sangat berbeda untuk membentuk molekul-molekul chimetric (misalnya molekul yang mengandung baik rangkaian DNA manusia maupun bakteri dengan cara yang tidak tergantung pada rangkaian), merupakan inti dalam riset DNA rekombinan.
Enzim-enzim endonuklease tertentu, yaitu enzim yang memotong DNA pada rangkaian DNA yang spesifik di dalam molekul (sehingga berbeda dengan enzim-enzim eksonuklease, yang mencernakan dari ujung-ujung molekul DNA), merupakan alat kunci dalam riset DNA rekombinan. Enzim-enzim ini pada mulanya dinamakan enzim restriksi, karena keberadaannya dalam dalam suatu bakteri tertentu akan membatasi pertumbuhan virus bakteri tertentu yang disebut bakteriofaga. Enzim restriksi memotong DNA menjadi sejumlah potongan pendek dengan cara spesifik-rangkaian yang berbeda dengan kebanyakan metode enzimatik, kimiawi ataupun fisika lainnya yang memutuskan DNA secara acak. Enzim-enzim defensif ini melindungi DNA bakteri yang menjadi hospes tehadap DNA dari organisme asing ( terutama organisme faga yang infektif). Enzim-enzim DNA metilase yang spesifik, tempat dan enzim restriksi selalu terdapat dalam bentuk pasangan didalam bakteri.
Enzim-enzim restriksi diberi nama menurut bakteri dimana enzim tersebut diisolasikan. Sebagai contoh, Eco RI berasal dari Escherichia coli, dan Bam HI Bacillus amyloliquefaciens. Tiga huruf dalam enzim restriksi terdiri atas huruf pertama yang menyatakan genus (E) dan dua huruf berikutnya yang menyatakan spesies (co). Tiga huruf ini dapat diikuti dengan symbol strain (R) dan angka romawi (I) untuk menunjukkan urutan penemuan. Setiap enzim akan menbgenali dan memotong rangkaian DNA benang-benang yang spesifik, yaitu rangkaian dengan panjang 47 bp. Potongan DNA akan menghasilkan ujung tumpul atau ujung bertumpuk, menurut mekanisme yang digunakan oleh enzim tersebut.
Tahapan-tahapan dalam rekayasa genetika adalah sebagai berikut:
1.Membuat Kompeten Sel
Dalam rekayasa genetika atau bioteknologi proses transformasi gen pada bakteri, khususnya pada Escherichia coli, membuat kompeten sel merupakan salah satu langkah yang penting. Tujuan proses kompeten sel adalah untuk mengkondisikan sel bakteri sehingga dapat menyerap DNA yang berbentuk sirkuler dalam proses kompeten sel.
Pada proses kompeten sel membran sel bakteri akan membentuk suatu pori-pori yang dapat dimasuki oleh DNA sirkuler. Bakteri yang diperlakukan dengan kalsium klorida (CaCl2) mampu menyerap DNA bacteriophage l. Kemampuan bakteri yang telah kompeten untuk menyerap DNA adalah sangat singkat yaitu sekitar 1-2 hari, kecuali diperlakukan dengan penyimpanan yang benar.
2. Transformasi Sel Kompeten
Transformasi merupakan proses untuk memasukkan DNA plasmid hasil konstruksi yang telah mengandung gen target ke dalam sel target. Proses transformasi ke sel bakteri pada umumnya menggunakan metode heat shock, tetapi dapat juga menggunakan metode listrik secara elektroporasi. Penggunaan metode heat shock juga lebih murah dibandingkan dengan metode elektroporasi.
Dalam proses transformasi gen ke sel bakteri, macam vektor plasmid yang digunakan harus diketahui karakternya dengan jelas, terutama sistem ekspresi dan macam gen ketahanan terhadap antibiotik yang digunakan. Pada umumnya, sistem ekspresi yang digunakan adalah sistem operon yang dapat diinduksi oleh senyawa tertentu. Kebanyakan operon yang digunakan adalah lactose operon yang dapat diinduksi oleh senyawa IPTG ( iso-propyl–thio-galaktosidase). Lac-operon digunakan untuk mengekspresikan gen yang mengkode enzim beta galaktosidase. Enzim ini akan mengkonversi senyawa 5-bromo-4-cloro-3indolil-beta-D-galaktosidase (X-gal) yang tidak berwarna menjadi derivat indigo yang berwarna biru. Apabila gen Lac Z disisipi oleh sekuen DNA tertentu, maka gen Lac Z-nya terputus sehingga enzim beta galaktosidase tidak terbentuk. Akibat tidak terbentuknya enzim beta galaktosidase, maka substrat X-gal tidak dikoversikan menjadi derivat indigo sehingga koloni tetap berwarna putih. Dengan demikian, koloni yang berwarna putih adalah koloni yang berhasil ditransformasi, .sedangkan koloni barwarna biru merupakan bakteri yang tidak tertransformasi. Seleksi dengan metode ini disebut dengan blue white colony selection. Blue white colony selection merupakan salah satu cara dalam menseleksi bakteri yang telah berhasil ditransformasi.
3. Seleksi Bakteri Transforman
Untuk mengetahui bakteri mana yang telah berhasil ditransformasi plasmid hasil konstruksi yang memiliki gen untuk mengekspresikan sifat resistensi terhadap antibiotik tertentu, bakteri tersebut kemudian dikulturkan dalam medium yang mengandung antibiotik tersebut. Bakteri yang tidak berhasil ditransformasikan dengan plasmid hasil konstruksi tersebut akan mati karena tidak memiliki plasmid sehingga tidak resisten terhadap antibiotik. Bakteria yang dapat tumbuh akan dipisahkan antara satu dengan lain dan dibiarkan tumbuh membentuk koloni. Perlu diingatkan bahwa proses ini melibat beribu-ribu plasmid dan DNA sasaran yang tidak dapat dilihat dengan mata kasar. Plasmid umumnya dalam bentuk larutan cair.
Tidak semua plasmid dapat dikonstruksi dengan enzim restriksi. Walau dapat dikonstruksi, tidak semua plasmid dapat disisipkan dengan DNA target. Ada plasmid yang dapat dikonstruksi dan dapat menyatu kembali tanpa bergabung dengan DNA target. Walaupun ada plasmid yang dapat dilakukan penyisipan, tidak semua berhasil ditransfomasi ke dalam sel bakteri traget. Dengan ini perlu dilakukan seleksi untuk memilih hanya sel perumah yang hanya mengandung DNA rekombinan (rDNA). Saringan yang pertama dilakukan dengan menggunakan penanda saringan terhadap antibiotik. Andaikan plasmid yang dipilih mempuyai resitensi terhadap antibiotik ampicilin (ampR) dan lac Z sebagai tapak pemotongan enzim EcoRI yang digunakan untuk mensintesiskan b-galaktosidase jika melakukan lac operon. Sekiranya sel perumah gagal ditransformasikan vektor plasmid, maka sel perumah tersebut tidak mempunyai plasmid untuk daya tahan terhadap antibiotik dan sel perumah tersebut musnah. Dengan itu kita dapat memilih sel perumah yang mana ada vektor plasmid atau tidak. Masalah selanjutnya adalah adakah sel perumah tersebut mengandung plasmid yang telah telah dipotong oleh enzim pembatasan atau tidak. Pemecahannya adalah dengan dilakukan dengan mengkultur bakteria tersebut dalam medium X-gal (mengandung laktosa). X-gal akan berubah warna menjadi biru sekiranya menyatu dengan b-galaktosidase. Lac Z dipotong oleh enzim restriksi untuk tujuan penyisipan DNA sumber, dengan itu bakteria lac Z menjadi rusak dan tidak berupaya mensintesis bgalaktosidase dan akan menghasilkan koloni berwarna putih di dalam medium X-gal. Masalah ketiga adakah plasmid yang telah dikonstruksi oleh enzim restriksi tersebut akan disisipkan oleh DNA sumber atau plasmid tersebut timbul kembali tanpa bergabung dengan DNA sumber. Proses seterusnya ialah identifikasi gen melalui ‘genetic probe’. Genetic probe adalah segmen RNA atau segmen rantai tunggal DNA yang menjadi pelengkap kepada gen yang diperlukan dan telah ditandai dengan bahan radioaktif.
Koloni sel perumah yang mengandung plasmid dipindahkan kepada membran nilon. Membran nilon akan diberi dengan ‘genetic probe’ yang akan berpasangan dengan bes-bes pada rDNA yang telah terbuka. Kemudian akan dibilas sekiranya bes yang tidak berikatan akan disingkirkan dan bes yang berikatan akan tetap berada dalam membran. ‘Genetic probe’ kemudian difoto dengan film x-ray. Dengan itu kita dapat memilih sel perumah yang mengandung DNA rekombinan.
4. Pemotongan DNA dengan Enzim Endonuklease dan Elektroforesis
Enzim restriksi (endonuklease) adalah enzim yang berasal dari bakteri yang berasal dari bakteri yang mampu memotong DNA double strain. Istilah enzim restriksi berasal dari kenyataan bahwa enzim ini merupakan produk dari satu straind bakteri yang membatasi pertumbuhan berikutnya dari bakteri lain tertentu pada medium yang sama Dalam sel bakteri, enzim ini berfungsi sebagai perlindungan diri dengan cara memotong DNA asing pada sisi pemotongan tertentu. Endonuklease dapat mengenal urutan (sekuen) nukleutida pendek, antara 4-8 nukleutida, yang sering dikenal sebagai restriction site atau sisi pemotongan atau situs pemotongan yang spesifik dan berbeda-beda.. Telah diketahui kira-kira 200 enzim restriksi dan masing-masing enzim restriksi memotong DNA rantai ganda pada urutan spesifik dari 4 atau 6 basa. EcoRl merupakan salah satu enzim restriksi yang memotong DNA rantai ganda dimana urutan basa-basanya adalah guanin, adenin ,adenin, timin, timin, dan sitosin .
G A A T T C
C T T A A G
Karena EcoRl memotong setiap DNA hanya pada urutan yang benar, maka DNA yang berasal dari sumber–sumber yang jelas berbeda dapat dipotong dan disambung bersama berdasarkan adanya ekor-ekor rantai tunggal yang komplementer yang disebut ujung staggered. Pemotongan yang sempurna dari DNA total dengan enzim ini akan memotong DNA tadi apabila terdapat urutan GAATTC dan apabila setiap plasmid mempunyai DNA identik, maka DNA total akan selalu dipotong oleh EcoRl menjadi fragmen-fragman yang sangat banyak yang tepat sama.
5. Elektroforesis dengan Agarose Gel
elektroforesis dengan agarose gel digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Fragmen (potongan) DNA berukuran lebih kecil akan bergerak dari kutub (-) ke kutub (+) akan lebih cepat dibandingkan dengan DNA yang berukuran besar. Untuk mengetahui besar suatu fragmen DNA ditentukan marker DNA yang telah diketahui ukurannya.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar