Isolasi plasmid dari bakteri E.coli dapat menggunakan banyak metode dan salah satunya adalah metode mini prep, Metode ini dinamakan metode mini prep karena sampel yang dipreparasi hanya dalam jumlah kecil dan juga karena metode ini menggunakan bahan yang sedikit dan waktu yang singkat. Percobaan ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid pGem 3 zf dari bakteri E.coli dan menghitung konsentrasi DNA plasmid tersebut dengan menggunakan alat spektrofotometer UV yang nantinya akan diperoleh panjang gelombang dan absorbansi dari larutan DNA. Langakah pertama yang dilakukan adalah memasukkan bakteri plasmid pGem3zf, kemudian disentrifuge selama 5menit lalu hasilnya terdapat supernatan dan pellet. Supernatan tersebut dibuang kemudian diulangi langkah seperti diatas lagi. Pellet yang didapat disuspensikan dengan larutan I yang steril dan dingin kemudian divortek dan ditambahkan enzim lisosim yang berfungsi untuk memecah dinding sel Dengan mengetahui kadar DNA plasmid maka akan diketahui kemurnian dari DNA plasmid yang telah di isolasi . Isolasi plasmid ini dilakukan untuk mendapatkan DNA plasmid yang akan digunakan untuk percobaan pemotongan DNA. Untuk mengisolasi DNA plasmid, telah disiapkan kultur bakteri E.coli dalam medium cair. Mula-mula kultur bakteri E. coli sebanyak 1,5 mL dimasukkan dalam tabung mikro sentrifuge, kemudian kultur bakteri tersebut disentrifuse pada 5000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºC. Hal ini dilakukan untuk mengendapkan bakteri, setelah itu supernatan dibuang dengan cara dituang dengan hati-hati ke dalam beker glass. Diusahakan agar pellet yang didapatkan tidak ikut terbuang. Tambahkan lagi sejumlah sama kultur bakteri lalu disentrifuse lagi hingga diperoleh pellet yang lebih banyak. Pellet yang didapatkan disuspensikan dalam 200 μL larutan I yang dibuat dari campuran 25 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 50 mM Glukosa ; dan 10 mM EDTA. Larutan I ini berfungsi untuk membuat DNA terlihat. Supaya DNA tersuspensi dengan sempurna, maka suspensi tersebut divorteks, kemudian ditambah dengan enzim lisozim sebanyak 10 μL dan di bolak-balik agar enzim tercampur. Enzim lisozim berfungsi untuk memecah dinding sel dan membran sel bakteri agar DNA plasmid dapat diisolasi. Selanjutnya, susupensi diinkubasi pada suhu 37ºC selama 15 menit agar enzim bekerja memecah dinding dan membran sel bakteri dengan optimal. Setelah 15 menit, suspensi tersebut di tambah dengan 400 μl larutan II yang berisi 0,2 N NaOH; 1% SDS (sodium dedocyl sulphate). SDS merupakan detergent bermuatan negative yang berguna untuk melepaskan protein yang menempel pada plasmid. Suspensi kemudian diinkubasi dalam es selama 10 menit. Setelah 10 menit, ditambah dengan larutan III yang berisi kalium asetat sebanyak 300μl, lalu diinkubasi dalam es selama 10 menit. Sel bakteri akan pecah, kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC sehingga akan di dapatkan supernatan yang berisi DNA dan pellet yang mengandung dinding sel, protein, karbohidrat dan lipid bakteri yang sudah lisis. Supernatan kemudian dipindah ke tabung mikrosentrifuges lain lalu ditambah dengan isopropanol 0,6 kali volume supernatan (supernatan yang diambil sekitar 800μl, jadi 0,6x800=480μl). Isopropanol berfungsi untuk mengendapkan atau menggumpalkan DNA. Supernatant tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu -20ºC agar DNA membentuk gumpalan dan akan terlihat seperti lendir yang melayang-layang. Namun karena terlalu sedikit, DNA tidak dapat terlihat maka supernatan dipresipitasi (diendapkan) lagi selama 30 menit. Setelah terlihat ada bentukan lendir yang melayang-layang, supernatan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC untuk mengendapkan DNA, maka akan didapatkan endapan DNA di dasar tabung mikrosentrifuges. Supernatan dibuang dengan hati-hati agar pellet tidak ikut terbuang (dengan cara ditempelkan ke tisu). Endapan DNA dicuci dengan 1 mL etanol 70%, dan disentrifuse pada 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºC. Etanol dibuang dan endapan DNA dikeringkan dari etanol menggunakan pompa vakum selama 10-15 menit atau sampai bau etanol hilang. DNA yang diperoleh dilarutkan dalam 100μL buffer TE (Tris EDTA pH 8,0). Etanol harus benar-benar hilang agar endapan DNA tersebut mudah larut dalam buffer TE fungsi etanol disini adalah untuk membuang sisa dari isopropanol yang masih ada. Selanjutnya, DNA diukur konsentrasinya dengan menggunakan spektrofotometer UV. Apabila kandungan protein tinggi, maka konsentrasi DNA rendah. Konsentrasi DNA dihitung dengan menggunakan rumus berikut :
[DNA] = (Abs 260 nm sample – Abs 260 nm air) x 40μg
V sample
Keterangan :
[DNA] : konsentrasi DNA yang diukur
Abs 260 nm : nilai absorbansi yang di peroleh pada panjang gelombang 260 nm
V sampel : volume sampel = 7,5μl
Tidak ada komentar:
Posting Komentar